Новости

Feb 28, 2024

Рациональный дизайн алкогольной ферментации, нацеленный на внеклеточный углерод

npj Science of Food, том 7, номер статьи: 37 (2023) Цитировать эту статью 221 Доступ 3 Подробности об альтметрических метриках Выведение штаммов дрожжей для промышленного алкогольного брожения требует кропотливых усилий.

npj Science of Food, том 7, номер статьи: 37 (2023) Цитировать эту статью

221 Доступов

3 Альтметрика

Подробности о метриках

Селекция штаммов дрожжей для промышленного алкогольного брожения требует кропотливого скрининга из-за отсутствия стратегий модификации in vivo. Здесь мы показываем, что утолщение клеточной стенки, специфичное для покоя, за счет синтеза основного компонента, 1,3-β-глюкана, критически противодействует способности клеточной ферментации, изолируя доступные цитоплазматические источники углерода. Это исследование дает представление о гликолитическом контроле и сообщает об эффективной и надежной рациональной схеме ферментации.

Современное понимание гликолиза основано на изучении дрожжевого алкогольного брожения1. Гликолитический контроль является центральной проблемой клеточного метаболизма2. Сильно оптимизированное гликолитическое поведение дрожжей, известное как эффект Крэбтри3, препятствует развитию технологии селекции для изменения способности алкогольного брожения. Протеинфосфатаза 2А (PP2A) в комплексе с регуляторной субъединицей типа B55δ (Cdc55p) несет исключительную ответственность за выдающуюся гликолитическую активность штаммов сакэ дрожжей Saccharomyces cerevisiae4. Высокие уровни глюкозы активируют PP2AB55δ как у дрожжей, так и у млекопитающих. У человека метаболизм глюкозы в печени запускает PP2AB55δ-зависимое дефосфорилирование фосфофруктокиназы-2/фруктозо-2,6-бисфосфатазы, способствуя выработке ключевого гликолитического активатора, фруктозо-2,6-бисфосфата5,6. Однако у S. cerevisiae его роль в гликолитическом контроле остается сомнительной7. Таким образом, механизм, лежащий в основе PP2AB55δ-опосредованной дрожжевой алкогольной ферментации, остается неизвестным.

Секвенирование РНК клеток S. cerevisiae cdc55Δ, специфически дефектных по функции PP2AB55δ, при входе в клеточный покой на начальной стадии ферментации выявило активацию стресс-чувствительных генов под контролем избыточных факторов транскрипции, таких как Msn2p, Msn4p (Msn2/ 4p) и Gis1p, функционально связанные с FoxO8 млекопитающих (дополнительный рисунок 1, дополнительные таблицы 1 и 2). Потеря Cdc55p привела к значительному увеличению экспрессии этих генов Msn2/4p-зависимым образом (рис. 1a, b, дополнительная рис. 2). Это было неожиданно, поскольку потеря Cdc55p снижает остро реагирующую на стресс экспрессию идентичных генов в экспоненциально пролиферирующих клетках (дополнительный рисунок 3)9. Таким образом, PP2AB55δ проявляет противоположные эффекты при активации Msn2/4p в фазах покоя и пролиферации (дополнительный рисунок 4). Удаление генов MSN2/4 на фоне cdc55Δ почти полностью восстановило фенотип плохой ферментации (рис. 1c и дополнительный рисунок 5), что позволяет предположить, что Msn2/4p является основным гликолитическим ингибитором.

Потеря PP2AB55δ (cdc55Δ) усиливает экспрессию генов, нацеленных на Msn2/4p, на ранней стадии ферментации. Ось y обозначает относительные уровни экспрессии по сравнению с 6-часовыми образцами дикого типа. Значения представляют собой средние значения и стандартные отклонения трех независимых экспериментов. б cdc55Δ усиливает ядерную локализацию Msn2p-GFP на ранней стадии ферментации. Прутки, 5 мкм. в Низкая ферментационная способность клеток cdc55Δ в основном зависит от Msn2/4p. WT, дикий тип. (г, д) cdc55Δ усиливает Msn2/4p-зависимый синтез 1,3-β-глюкана. d Уровни 1,3-β-глюкана в клетках через 24 часа после инокуляции. Значения представляют собой средние значения и стандартные отклонения трех независимых экспериментов. e TEM-наблюдение дрожжевых клеток через 24 часа после инокуляции. Человек, маннопротеины; βGlc, слой β-глюкана; ПМ – плазматическая мембрана; Цит, цитоплазма. Бары, 100 нм. е Гипотетическая модель внеклеточного связывания углерода посредством PP2AB55δ и Msn2/4p. Glc-глюкоза, Glc-6-P глюкозо-6-фосфат, Glc-1-P глюкозо-1-фосфат, UDPG УДФ-глюкоза, транспортер гексозы HXT, GS 1,3-β-глюкансинтаза. Звездочки обозначают значения, которые статистически отличаются от WT, как определено с помощью t-критерия Стьюдента, p <0,05.

Msn2/4p активирует гены пути синтеза UDP-глюкозы, который напрямую ответвляется от гликолиза через глюкозо-6-фосфат10. УДФ-глюкоза в основном используется в качестве субстрата для биосинтеза трегалозы, гликогена и 1,3-β-глюкана у S. cerevisiae. Цитоплазматические трегалозные и гликогеновые шунты временно активируются при остром стрессе или вступлении в состояние покоя; следовательно, удаление ни генов трегалозы, ни генов синтеза гликогена не вносит положительного вклада в алкогольное брожение11. Напротив, 1,3-β-глюкан накапливается в период ферментации, и его внеклеточная деградация не обеспечивает немедленного восполнения гликолиза. Таким образом, синтез 1,3-β-глюкана в покоящихся клетках может участвовать в метаболическом контроле за счет выброса ферментируемых источников углерода во внеклеточное пространство. Количественный анализ клеточной стенки (рис. 1г) и трансмиссионная электронная микроскопия (рис. 1д) выявили заметное утолщение 1,3-β-глюкана в ферментирующих клетках cdc55Δ и его полное отсутствие в клетках cdc55Δ msn2/4Δ, что обратно коррелирует со скоростью ферментации. Следовательно, гиперактивированный синтез 1,3-β-глюкана ответственен за плохой фенотип ферментации клеток cdc55Δ.